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怎样选择适合的荧光探针(总结)
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亲和层析纯化的抗HRP及其耦联物的抗体可以用来检测HRP或者放大含有HRP试剂的效果。哺乳动物细胞的免疫染色中。因此这个抗体的优势就是可以降低背景。由于抗HRP抗体不识别内源性的过氧化物酶的类似酶。A minomethylcoumarinAcetatAMCA 耦联的AMCA 吸收光波长最大为350nm发荧光则为450nm对于荧光自准直仪来说。用紫外滤板来观察。由于AMCA 信号相对较弱,AMCA 可以用汞灯来激发。单标实验中不推荐使用AMCA AMCA 和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围,而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠,因此它最常用于多标记实验中,比如免疫荧光自准直仪和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光,多标记的实验中,AMCA 耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA 和荧光素一样很快淬灭,使用抗淬灭剂可以减轻。如果使用在流式细胞仪中,AMCA 可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发,因为它发出的光线是光谱的紫外区。 FluoresceinIsothiocyanFITC 耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm发射的最大波长为520nm由于FITC被使用了很长时间而且产量很大。因此要和抗淬灭剂一起使用。DTA F荧光素的一个衍生物,FITC被广泛应用。荧光素的最大缺点是淬灭快。激发和发射波长均和FITC相同。当和链霉亲合素耦联时,因为荧光强度上有明显的区别,最好不使用FITC而使用DTA F CyanindyeCy2.Cy5 Cy3. Cy2耦联基团激发波长为492nm发光为波长510nm绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂。染色片贮存后会导致荧光微弱和扩散。因为这种抗淬灭剂和Cy2反应。 背景更弱。荧光自准直仪的Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm最强发射光为570nm因为激发光和发射光波长很接近PITC,更稳定。Cy3和Cy5比其他荧光团探针要更亮。荧光自准直仪中,可使用和PITC一样的滤波片。 氦氖灯(543nm或者汞灯(546nm下则约75%。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦自准直仪实验中作多标记。 Cy3氩光灯(514nm或528nm下可以被激发出50%的光强。 Cy5耦联基团的激发波长最大650nm发光波长最大670nm氪氩灯(647nm下它可被激发出98%的荧光。而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦自准直仪。水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用保守的外表荧光自准直仪时,氦氖灯下(633nm为63%。Cy5可以和很多其他荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它最大发射波长在670nmCy5很难用裸眼观察。不推荐使用Cy5 TetramethylRhodaminIsothiocyanPITC TexaRedP RhodaminRed-XRRX. RRX尤其有用,可以和Cy2或者FITC和Cy5一起使用,因为RRX发射波长在Cy2和Cy5中间,而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm598nm和647nm分别是Cy2FITC,使用RRX和P可以得到更好的颜色区分。使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描自准直仪作三标记的实验时。这些若丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 550,570,596nm和最大发射波长(570,590,620nm尽管PITC经常和FITC一起在双标记实验中使用。RRX和Cy5理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发,流式细胞仪中用FITC作双标,另一种用藻红蛋白(PE耦联基团要比若丹明好, 总结下来 荧光团探针的选择有两个重要标准: A. 荧光自准直仪的光源,滤片,检测系统。 B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。 例如,若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。 C. 灵敏度。比如,Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。


 
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