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怎样使用共聚焦自准直仪进行蛋白定位
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用荧光自准直仪细胞内自由钙离子浓度测量 要用一个线粒体特异性的探针或者线粒体特异性定位的蛋白做免疫荧光以标记线粒体的位置,再以一种不同颜色的二抗标记目的蛋白,最后观察两种荧光的叠加情况。如果需要更精确的可以分离线粒体后用western blot检测。如果想用形态学方法建议共聚焦或者免疫电镜,选一种吧,但是看过很多线粒体的文章,用共聚焦的更多,不过需要根据的实际情况吧,免疫电镜也是认可的。 Ca2+作为细胞内的第二信使,调控着许多重要的生理活动。从六十年代开始,一些研究小组就已经开始合成各种荧光剂进行定量检测Ca2+浓度,目前常用的荧光剂有第二代的fura-2, indo-1, rhod-2以及第三代的Fluo-3, Fluo-4, Fluo-5系列、Calcium Green等。 计算细胞内游离钙离子浓度的公式根据不同荧光剂分两种情况。 第一种是单激发荧光剂(如Fluo-3) [Ca2+]=Kd[F-Fmin]/[Fmax-F] 其中,Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数。Fmin是荧光剂没有结合Ca2+时荧光最小值;Fmax是荧光剂被Ca2+饱和时的荧光最大值。 第二种是双激发荧光剂(如fura-2) [Ca2+]=Kd[R-Rmin]/[Rmax-R] 其中R=F1/F2, F1为激发波长1的荧光强度,F2为激发波长2的荧光强度。Rmin是Ca2+浓度为零时,荧光最小比值,Rmax为饱和浓度的荧光最大比值。 荧光强度测量方法可以用荧光自准直仪、共聚焦自准直仪和近几年兴起的双光子荧光自准直仪。荧光自准直仪一般采用氙灯、汞灯等光源;共聚焦自准直仪采用激光为激发光源,优点是得到很高的分辨率,记录钙离子三维空间分布;双光子荧光自准直仪则采用红外激光作为光源,具有很高空间分辨率,而且背景噪声比较低。


 
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